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果胶物质的测定上海液质检测 [复制链接]

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果胶物质(PecticSubstances)是一种植物胶,可作为食品生产中的胶冻材料和增稠剂。果胶在医药上可以作为治疗胃肠道及胃溃疡等疾病的良好药剂。果胶,特别是低甲氧基果胶,因为它能与铅、汞等有害金属形成人体不能吸收的不溶解物,因而可用作金属中*的一种良好解*剂和预防剂。可见,果胶的生产和应用,将会得到很快的发展。

关于果胶物质的构造尚未完全清楚。它是一群复杂的胶态的碳水化合物衍生物。有人认为果胶物质是一种均多糖。但多数人认为果胶物质是半乳糖醛酸与鼠李糖所组成的杂多糖。另外,许多植物的果胶物质中尚含有阿拉伯树胶(arabinan)、聚半乳糖和阿拉伯聚半乳糖。

简单说,果胶物质的最大特征就是含有聚半乳糖醛酸。这些半乳糖醛酸的羧基可能有一部分被甲基酯化,一部分或全部被大碱所中和。

为了求得名词的统一,根据它的结构和某些性质,美国化学协会等组织给各种不同果胶物质定义如下∶

(1)原果胶(Protopectin)。植物在未成熟前,果胶物质相互间,或它与半纤维素及钙盐之间,以机械方式或化学方式相结合,形成了不溶于水的物质。原果胶可以成为一种不溶于水的、亲水能力很大的结合剂,这时原果胶具有增稠作用。

在酶的作用下,草莓等成熟的果实和胡萝卜等蔬菜中的原果胶,能逐渐变为果胶酯酸。于是,一部分果胶物质呈溶解状态而存在细胞液中。原果胶在水或酸性溶液中加热,也同样可转变为果胶酯酸。

(2)果胶酯酸(Pectinicacid)。它的基本结构是多聚半乳糖醛酸,呈胶态。其中甲基酯的含量是可变的。酯化程度%的完全甲基化的果胶酯酸,甲氧基(CH3O—)含量为16.32%。按甲氧基含量的不同,果胶酯酸分为两类。甲氧基含量大于7%的,叫作高甲氧基果胶(又称果胶,Pectin);甲氧基含量小于7%的,叫作低甲氧基果胶(又称低酯果胶)。果胶酯酸与糖和酸在适当条件下能形成凝胶。甚至,不用加糖,只要有多价正离子存在,,低酯果胶也可形成凝胶。果胶酯酸的游离羧基与金属离子可形成正盐或酸式盐。

(3)果胶酸(Pecticacid)。它的基本结构是聚半乳糖醛酸,呈胶态。它同果胶酯酸的差别是其中的羧基是游离的,不以甲基酯的形式存在,但实际很难得到无甲酯的果胶物质。通常,把甲氧基含量为1%的,叫作果胶酸。天然的果蔬,仅含有少量果胶酸。而在酶的作用下,水溶性的果胶物质可以转变为果胶酸。果胶酸的游离羧基与金属离子也形成正盐或酸式盐。

关于果胶物质的测定,通常采用的方法有重量法、果胶酸钙滴定法(即用乙二胺四乙酸二钠标准溶液滴定果胶酸钙中的钙量)和咔唑反应比色法等。上述测定方法中,果胶酸钙滴定法较适于纯果胶的测定。当样品有色时,不易确定滴定终点。且由不同试样得到的果胶酸钙,其组成各不相同,分析果胶酸钙中的钙量不能用来计算果胶的实际含量。因此,应用范围受到一定限制。测定方法有重量法、比色法等。

一、质量法

方法原理

将果胶物质从样品中提取出来,加入氯化钙生成不溶于水的果胶酸钙,测其果胶酸钙质量或换算成果胶酸的质量。

试剂

(1)0.1mol·L-INaOH溶液。称取化学纯NaOH4g加水溶解,然后稀释至0mL。

(2)1mol·L醋酸溶液。取化学纯冰乙酸58.3mL,加水稀释至0mL。

(3)0.1mol·L~CaCl2溶液。称取分析纯无水氯化钙5.5g,加水溶解后,稀释至mL。

(4)2mol·LCaCl2溶液。称取分析纯无水氯化钙g,加水溶解后,稀释至mL。

操作步骤

(1)样品处理。样品中存在果胶酶时,为了钝化酶的活性,可以加入热的ml.·L乙醇,使样品溶液的乙醇最终浓度调整到mL·L-以上。然后加热煮沸1.5h,过滤后,以mL·L-’乙醇洗涤多次,再以乙醚处理。这样,可除去全部糖类、脂类及色素,乙醚则挥发除去。干燥的样品需要磨细,细度为60目。

(2)提取。

①总果胶物质

新鲜样品称取磨碎的样品50g。置于0mL烧杯中,加入0.05mol-L-AHClmL,在80~90℃加热2h。加热时随时补充蒸发损失的水分。冷却后,移入mL容量瓶,加水稀释定容,过滤。

干燥样品称取样品5g,置于mL三角瓶中,加入加热至沸的0.05mol·L~HClmL,连接冷凝器,加热煮沸1h,冷却至室温,用水定容至mL,摇匀,过滤。

②水溶性果胶物质。将样品研碎。新鲜样品准确称取30~50g;干燥样品准确称取5~10g。以mL水将样品移入mL烧杯中。加热至沸,保持沸腾1h。加热时随时补足蒸发所损失的水分。把杯内物质全部移入mL容量瓶内,加水定容。过滤。

(3)测定。吸取一定量滤液,其量相当于能生成果胶钙约25mg。将提取液放入0mL烧杯中,中和后,加水至mL,加入0.1mol·LNaOH溶液mL,充分搅拌,放置过夜,以皂化之(脱去甲氧基,使生成果胶酸钠)。加入1mol·L-HOAc溶液50mL。5min后,加入0.1mol·L~CaCl2溶液25mL,然后,一边滴加2mol·L~1CaCl2溶液25mL一边充分搅拌。放置1h后,加热5min,趁热以直径11cm的折叠滤纸过滤,用热水洗涤至不含有氯化物,然后,用热水把滤纸上的沉淀无损地洗入原先的烧杯中,加热煮沸数分钟,用已知重量的玻璃砂蕊漏斗(1G2)过滤,在℃烘1.5h后称重,再放入烘箱继续干燥至恒重为止。

结果计算

计算方式有两种,一种用果胶酸钙表示,另一种用果胶酸表示。

二、比色法(注1)

方法原理

方法基于果胶物质水解,生成半乳糖醛酸在强酸中与咔唑的缩合反应。然后,对其紫红色呈色溶液进行比色定量。

试剂

(1)乙醇(化学纯)。无水乙醇和mL·L-1乙醇。

(2)精制乙醇。取无水乙醇(化学纯)或mL·L乙醇0mL,加入Zn粉4g和硫酸(1∶1)4mL,置恒温水浴中回流10h后,用全玻璃仪器蒸馏。馏出液每0mL加入Zn粉和KOH各4g,进行重蒸馏。

(3)1.5g·L-I咔唑乙醇溶液。称取化学纯咔唑0.g,溶解于精制乙醇,并定容至mL。

(4)标准半乳糖醛酸。以医药公司上海化学试剂采购供应站分装的L.Light出品a-D水解半乳糖醛酸作为标准半乳糖醛酸。

(5)浓硫酸(优级纯)(注2)。

(6)0.05mol·L-HCI溶液。

操作步骤

(1)半乳糖醛酸标准曲线的制作。准确称取α-D-水解半乳糖醛酸mg,溶解于蒸馏水,并定容至mL,混合后得1mg·mL-1的半乳糖醛酸原液。移取上述原液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL,分别注入mL容量瓶中,稀释至刻度,即得一系列浓度为10、20、30、40、50、60、70μg·mL-

的半乳糖醛酸标准溶液。

取30mm×mm的硬质大试管7支,用吸管注入浓H2SO4。各12mL。置冰水浴中冷却,边冷却边分别沿壁徐徐加入上述不同浓度的半乳糖醛酸标准溶液各2mL,充分混合后,再置冰水浴中冷却。然后,在沸水浴中加热10min,冷却至室温后,加入1.5g·L~1咔唑溶液各1mL,充分混和。另以蒸馏水代替半乳糖醛酸标准溶液,依上法同样处理,作为试剂空白对照。室温下放置30min后,用型分光光度计,在波长mm下,分别测定其吸光度(A),以测得的吸光度(A)为纵坐标,每毫升标准溶液中半乳糖醛酸的含量为横坐标,制作标准曲线。

(2)样品中果胶物质的提取和测定。称取番茄原浆和番茄汁20g,注入mL烧瓶中,加入无水乙醇mL,充分搅拌混和后盖以表玻璃。在85~90℃恒温水浴上加热20min,冷却,并静置1h后,用1G3玻璃滤器,在轻微抽气下过滤,弃去含糖的乙醇滤液。沉淀用乙醇分次洗涤,除去糖分,直至滤液无色,用穆立虚反应法(*)检验至无糖或接近无糖的反应为止(半)。然后,将沉淀移入mL三角烧瓶,并用mL加热至沸的0.05mol·L-1HCl溶液将滤器上残留的沉淀无损地洗入同一烧瓶中,摇匀,接上回流冷凝管,在沸水浴上抽提1h,冷却至室温,用蒸馏水定容至mL。混合,先经脱脂棉粗滤,再用滤纸过滤。移取上述澄清的提取液10mL,注入mL容量瓶中,加水定容。然后,移取稀释液2mL按半乳糖醛酸标准曲线的制作法操作,测定其吸光度(法5.6),由标准曲线查出稀释液中半乳糖醛酸的浓度(pg*mL~1)。

结果计算样品中的果胶物质总量以半乳糖醛酸表示。

注释

注1.本试验方法较果胶酸钙重量法操作简易,快速,每份样品需6~8h。半乳糖醛酸标准加料的平均回收率达98.4%~.7%。样品的重现性较好,同一试样5次测定结果的标准偏差为±1.03%~3.71%,标准误差为±0.46~1.51。

注2.硫酸的浓度对半乳糖醛酸溶液的呈色有较大的影响。半乳糖醛酸在低浓度的硫酸中与咔唑试剂的呈色度极低,甚至不起呈色反应而仅在浓HSO中,才可使其充分显色。此外,硫酸的纯度,对其呈色反应也有一定影响,测定样品时必须选用与标准曲线的制作相同规格和批次的硫酸,以消除其误差。

注3.糖分的穆立虚反应法检检。取待测检测0.5mL,注入小试管中,加入50g·L-1萘酚的乙醇溶液2~3滴,充分混合,此时溶液稍有白色混浊。然后,使试管稍稍倾斜,用吸管沿管壁徐徐加入浓硫酸1mL(注意水层与浓硫酸不可混和)。将试管稍予静置后,若在两液层的界面产生紫红色色环,则证明检液含有糖分。

注4.应用咔唑反应比色法测定果胶物质时,其试样的提取液必须是不含糖分的溶液。糖分的存在,对硫酸一半乳糖醛酸混合液的咔唑呈色引起较大的干扰,而使测定结果偏高。因此,从样品中提取果胶物质之前,用乙醇使果胶物质与其他多糖一起沉淀,并尽量洗涤除去糖分是十分重要的。

注5.试验结果证明,半乳糖醛酸溶液(或果胶物质提取液)与咔唑色反应所必须的中间化合物,在加热10min以后已经形成。加热30min或更长,该化合物依然稳定不变。

注6.当每一支试管中,添加1.5g·L-1咔唑溶液1mL时,其呈色度在30min内达到最高值且约20min内保持不变,然后,色泽较快消失。上述测定呈色迅速且具有适当的稳定性,能满足测定要求。

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