白癜风能治疗吗 http://pf.39.net/bdfyy/zqbdf/171209/5917246.html文章标题：Dualpromoterstrategyenhancesco-expressionofα-L-rhamnosidaseandenhancedfluorescentproteinforwhole-cellcatalysisandbioresourcevalorization
发表期刊：ScienceoftheTotalEnvironment
影响因子：7.
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引言
在我国，桑树是一种重要的农业资源，含有大量的类*酮，而桑树的枝条大多被丢弃作为废弃物，利用酶催化技术对该类农业废弃物进行高效利用是发展循环经济的有效途径。异槲皮苷是天然*酮的主要糖苷形式之一，具有抗病*、抗肿瘤、抗炎、抗菌等多种药理活性，但其在自然界中非常罕见。α-l-鼠李糖苷酶（EC3.2.1.40）属于水解酶家族，能够高效水解鼠李糖苷末端的α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6连接糖苷的基团。鼠李糖苷酶广泛应用于食品、医药等行业，可水解柚皮苷、橙皮苷、芦丁等*酮类化合物。因此，鼠李糖苷酶在制备高纯度*酮类化合物方面具有重要的经济意义。目前，双启动子表达系统为异种蛋白的生产提供了有益和有前景的解决方案，特别是对于靶向蛋白和荧光蛋白的共表达。此外，已有研究发现双启动子PgsiB-PHpaII效率最高。
简介
本文利用基因工程技术，将α-l-鼠李糖苷酶基因（rhaB1）与荧光蛋白基因（EGFP）通过含有两个多克隆位点的载体进行连接，并对表达的α-l-鼠李糖苷酶的性质进行分析。同时利用α-l-鼠李糖苷酶和全细胞催化体系将芦丁脱糖苷，合成异槲皮苷。探讨了不同因素对异槲皮苷合成的影响。本研究为芦丁酶催化水解生产高价值异槲皮苷提供了一个潜在的平台。
图文解读
图1：重组大肠杆菌BL21-pRSFDuet1-rhaB1-EGFP的SDS-PAGE分析。
●条带：M，kDa的蛋白Marker；1，重组大肠杆菌BL21-pRSFDuet1-rhaB1-EGFP细胞裂解液；2，重组大肠杆菌BL21-pRSFDuet1细胞裂解液。
●如图1的电泳图所示，在约kDa处观察到一个显著的特异性条带，这与rhaB1的分子量一致，这在未转化的BL21pRSFDuet1细胞的裂解液中没有看到，说明rhaB1在大肠杆菌中成功表达。
表1：rhaB1-EGFP纯化前后的酶活性测定。
●反应条件：酶和pNPR在40℃下预热4min，反应10min后加入2MNa2CO3终止。粗rhaB1-EGFP的酶活以%为参考。
●表1给出了从大肠杆菌中提取的粗rhaB1-EGFP、镍柱纯化后未结合的rhaB1-EGFP、预透析的rhaB1-EGFP以及纯化的rhaB1-EGFP的相对活性。粗rhaB1-EGFP的活性最高，纯化得到的未结合的rhaB1-EGFP的活性为48.36±1.5%。与前者相比，镍柱纯化后的rhaB1-EGFP活性进一步降低，仅保留41.9±2.9%的酶活性。此外，与粗rhaB1-EGFP相比，纯化的透析酶的相对活性仅为12.9±1.3%。为获得更好的催化效果，作者使用粗酶溶液进行进一步的实验。
图2：rhaB1和rhaB1-EGFP的最适温度和热稳定性。(A)rhaB1-EGFP的最佳温度。采用pNPR（1mM）与粗rhaB1-EGFP在不同温度下进行反应，以粗rhaB1-EGFP的酶活为%作为参考。(B)rhaB1-EGFP和(C)rhaB1的热稳定性。在不同温度、不同时间间隔下，对rhaB1-EGFP和rhaB1与pNPR反应10min，计算酶活。
●粗rhaB1-EGFP的最适温度和热稳定性试验结果分别如图2A和B所示。rhaB1-EGFP的最适温度为40℃，在30~45℃温度范围内保持80%以上的相对活性。当温度升高到55℃时，酶活性仅保持约0.8±1.4%，重组rhaB1-EGFP几乎完全失活，表明重组rhaB1-EGFP不耐高温。高温可使*酮类苷在生物转化反应中溶解，从热失活曲线可以看出，相对于rhaB1，rhaB1-EGFP具有较高的热稳定性，在35-45℃孵育1h后仍保持95%的初始活性。但在50℃处理30min时，其相对活性仅为10±5.3%，说明该酶在50℃下极不稳定。
●如图2C所示，对BL21-pET21a-rhB1表达的粗rhaB1的热稳定性测试结果显示，在35-40℃的温度范围内，rhaB1的相对活性保持在70%以上。45℃处理30min后，剩余酶活性基本丧失。由此可见，rhaB1-EGFP比rhaB1具有更强的耐热性。
图3：rhaB1和rhaB1-EGFP的最适pH。(A)rhaB1-EGFP的最适pH值。将pNPR（1mM）与粗rhaB1-EGFP在不同pH值下进行反应，以粗rhaB1-EGFP的酶活为%作为参考。(B)、(C)和(D)分别为在4℃、25℃和37℃时，rhaB1-EGFP和rhaB1的pH稳定性。将rhaB1-EGFP和rhaB1与pNPR在不同pH值、不同时间间隔孵育10min，计算酶活性。
●图3A显示了rhaB1-EGFP的最适pH。pH为6.5时酶活性最高。酸性条件下（＜5.5）的酶活性与碱性条件下（＞7）的酶活性成反比。在碱性pH范围为6~7时，相对活性较高（＞40%），高于文献报道的以pNPR为底物时从不同微生物中提取的α-l-鼠李糖苷酶的最适pH。
●图3B、C、D显示了粗rhaB1和rhaB1-EGFP在4℃、25℃、37℃下的pH稳定性，而rhaB1-EGFP在pH5~7之间具有高度稳定性。在4℃孵育1h后，rhaB1-EGFP在该pH范围内表现出80%以上的活性，而rhaB1仅保留了60%的活性。当两种酶分别在25℃和37℃孵育1h时，rhaB1-EGFP的pH稳定性优于rhaB1。
表2：比较rhaB1-EGFP与rhaB1、RhaB1对pNPR的水解作用。
●表2显示了粗rhaB1-EGFP与rhaB1（作者研究小组创建）和RhaB1（大象粪便衍生）在底物pNPR上的水解活性比较。rhaB1-EGFP的热稳定性结果显示，在40℃处理30min后，剩余酶的相对活性高达95%，高于rhaB1和RhaB1。RhaB1酶解pNPR的最大比活性仅为18.4U/mg，而rhaB1-EGFP酶解pNPR的最大比活性为29.5U/mg。因此，本文的双启动子表达系统所表达的rhaB1-EGFP具有较好的酶活性。
图4：rhaB1-EGFP表达与荧光强度的关系。(A)rhaB1-EGFP表达与荧光强度的关系。(B)rhaB1-EGFP表达与荧光强度的相关性。超声破碎细菌，开/关周期9s，共30个周期。超声缓冲液为pH7.4的PBS。用荧光计测量EGFP的荧光强度（最大激发波长和发射波长分别为nm和nm）。
●rhaB1-EGFP表达与荧光强度的关系如图4A所示。总的来说，荧光强度的增加趋势与rhaB1-EGFP表达的趋势基本一致，EGFP作为报告基因，可以检测到目的基因的表达水平。
●如图4B所示，将rhaB1-EGFP的表达与荧光强度水平拟合，rhaB1-EGFP表达（Y）与荧光强度（X）的关系表示为Y=-3.×10-5X2+0.X-1.，R2=0.。因此，利用该模型，只需简单测量荧光强度即可计算出rhaB1-EGFP蛋白的表达量。
表3：芦丁和两种蛋白亲和参数的SPR分析。
图5：rhaB1和rhaB1-EGFP与芦丁结合的SPR分析。芦丁试验液浓度为nM，预洗40s。芦丁与酶分子结合在40-s，解离在-0s。
●表3通过SPR分析得到了rhaB1和rhaB1-EGFP与芦丁的亲和参数，低KD值表明酶与底物之间的解离较小，亲和力较强。
●两个蛋白与芦丁的结合如图5所示，芦丁与rhaB1-EGFP、rhaB1无不可逆结合，rhaB1对芦丁的结合强度略高于rhaB1-EGFP对芦丁的结合强度，但差异不显著（P＞0.05），说明两种酶都能特异性结合芦丁。
图6：不同因素对粗rhaB1-EGFP及其全细胞催化芦丁生成异槲皮苷收率的影响。温度(A)、pH(C)和底物浓度(E)对粗rhaB1-EGFP催化芦丁生成异槲皮苷的影响。温度(B)、pH(D)和底物浓度(F)全细胞表达rhaB1-EGFP催化芦丁生成异槲皮苷产率的影响。反应条件：(A)芦丁浓度：0.01g/L，pH7.0，温度：30℃-50℃；(B)芦丁浓度：0.03g/L，pH6.5，温度：30℃-50℃；(C)芦丁浓度：0.01g/L，温度：40℃，pH4.5-7.5；(D)芦丁浓度：0.03g/L，温度：40℃，pH5.0-7.0；(E)温度：40℃，pH6.5，芦丁浓度：0.01-0.2g/L；(F)温度：40℃，pH6.0，芦丁浓度：0.01-0.2g/L。所有的反应都是在rpm的水浴摇床中进行的，持续24小时。
●图6A和B显示了温度（30-50℃）对常规体系中粗rhaB1-EGFP及其全细胞催化芦丁转化过程中异槲皮苷产率的影响。从图6A可以看出，当温度从30°C升高到40°C时，粗rhaB1-EGFP粗品芦丁的异槲皮苷产率有所提高，在40°C时获得了最大产率(80.8±2.3%)。从图6B可以看出，在30~50℃的温度下，异槲皮苷的产率始终为＞40%。随着温度从30℃升高到35℃，其值从50.85±3.8%逐渐升高到51.86±3.9%，但差异不显著(P＞0.05)。
●pH（5-7）对常规体系中rhaB1-EGFP粗品及其全细胞催化芦丁转化过程中异槲皮苷产率的影响如图6C和D所示。pH为4.5时，异槲皮苷产率仅为10%左右。这表明rhaB1-EGFP在强酸性环境中基本上是不活跃的，在pH为5到6的情况下，产量大致保持在相同的水平，pH值为6.5时产率最高，为82.02±4.3%，在pH值7，产量下降了35.4%。除了5到7的pH值范围，异槲皮苷产量都相对较低，表明rhaB1-EGFP在酸性和碱性条件下可能变性和灭活。此外，由图6D可知，全细胞催化芦丁水解的最优pH为pH6，低于粗rhaB1-EGFP（pH6.5）催化反应的最优pH，最高产量为83.9±3.7%，差异不显著（P＞0.05）。
●底物浓度对粗rhaB1-EGFP酶解芦丁生产异槲皮苷的影响如图6E所示。底物浓度为0.01和0.03g/L时，异槲皮苷的产率分别为91.67±2.4%和91.74±2.3%。随着芦丁浓度的增加，产率呈现明显的下降趋势。当底物浓度增加0.2g/L时，产物收率降低83%。这说明底物浓度越低，酶-底物结合越有效，而浓度越高（≥0.05g/L），酶-底物的抑制越明显。因此，粗rhaB1EGFP催化剂的最佳底物浓度为0.03g/L。
●图6F显示底物浓度对rhaB1-EGFP介导的芦丁生成异槲皮苷的全细胞催化作用的影响。底物浓度为0.05g/L时产率最高。随着芦丁浓度从0.01g/L增加到0.05g/L，产率从56.3±3.3%增加到92.5±4.8%。当底物浓度从0.05g/L增加到0.2g/L时，产率从71.2±2.7%下降到36.8±1.5%，分别比最高产率低23%和60%。结果表明，与原始的rhaB1-EGFP相比，表达rhaB1-EGFP的全细胞最优底物浓度更高，增加了其工业化应用的潜力。
表4：比较rhaB1和rhaB1-EGFP催化剂水解芦丁的性能。
●全细胞rhaB1的最佳反应温度和pH值高于游离rhaB1，这表明，全细胞催化剂对温度和pH值的宽容度高于游离rhaB1。对比粗rhaB1-EGFP和全细胞rhaB1-EGFP的催化性能，发现两者的最优反应温度相同时，后者的最优pH略有下降。生物膜可能通过在内源酶和环境之间提供一个保护屏障来控制传质，从而使酶在较低的pH值下仍能保持较高的活性。
●氯化胆碱-尿素（ChCl/U）处理后，全细胞rhaB1和rhaB1-EGFP的最佳反应温度和底物浓度相同。全细胞rhaB1-EGFP与rhaB1的催化效率和产物收率无显著差异，但后者的最优pH略低。虽然在产物产量上没有显著差异，但由于含rhaB1-EGFP的整个细胞具有蛋白在细胞内的定位和转运等特点，在实际应用中可以看到其优点。
总结与展望
利用双启动子载体pRSFDuet1从大肠杆菌中获得的重组rhaB1-EGFP水解pNPR的最适宜温度为40℃，比大肠杆菌pET21a获得的重组rhaB1低5℃。重组rhaB1-EGFP水解pNPR的最适pH为6~7，较rhaB1更接近中性pH。4℃和25℃处理1h后，pH为5~7时，rhaB1-EGFP活性保持在60%以上。而温度升高会影响rhaB1的pH稳定性，25℃处理1h后，在pH7时，rhaB1的相对活性几乎完全丧失。重组rhaB1-EGFP酶解芦丁制备异槲皮苷的最适温度为40℃，最适pH为6.5。底物浓度为0.03g/L时，产率为91.7±2.4%。此外，EGFP和rhaB1共同表达，可以实时监测催化过程中酶的消耗。
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