丁酸梭菌的生物学功能及在水产养殖中的应用
（1河南金百合生物科技股份有限责任公司河南安阳；2河南省饲用微生态制剂研究中心）
摘要：丁酸梭菌作为益生菌的一员，具有耐高热、耐酸碱和耐胆盐等多种生理功能，目前已在食品医药领域广泛应用。与其他益生菌相比，丁酸梭菌作为饲料添加剂在水产养殖业的应用仍处于初级阶段。文章介绍了丁酸梭菌的生理特征，以及在营养物质产生、调节肠道微生态、提高免疫力、修复肠屏障、抗应激等方面的作用机理，综述了丁酸梭菌在水产养殖中的应用效果，旨在为丁酸梭菌产业的健康发展及其在水产养殖绿色生产中的应用提供参考。
关键词：丁酸梭菌；生物学功能；应用
中图分类号：文献标识码：
BiologicalfunctionofClostridiumbutyricumanditsapplicationinaquaculture
HUWenpan1,LiKeke1
（1.HenanJinBaiHeBiotechnologyCo.,Ltd.,Anyang,HenanChina）
Abstract:Asoneoftheprobiotics,Clostridiumbutyricumhasavarietyofphysiologicalfunctionssuchashighheatresistance,acidandalkaliresistance,andbilesaltresistance.Ithasbeenwidelyusedinfoodandmedicine.Comparedwithotherprobiotics,theapplicationofClostridiumbutyricumasafeedadditiveinaquacultureisstillinitsinfancy.ThisarticleintroducesthephysiologicalcharacteristicsofClostridiumbutyricumanditsmechanismofactionintermsofnutrientproduction,regulationofintestinalmicroecology,improvementofimmunity,repairofintestinalbarrier,anti-stress,etc.,andsummarizestheroleofClostridiumbutyricuminaquacultureTheeffectoftheapplicationistoprovideareferenceforthehealthydevelopmentoftheClostridiumbutyricumindustryanditsapplicationinthegreenproductionofaquaculture
Keywords:Clostridiumbutyricum;mechanism;application
丁酸梭菌(C.butyricum)又名酪酸菌，梭菌属(Clostridium)，是一类广泛存在于土壤、人和各类动物肠道中的正常菌群之一。最早于年由日本的宮入进治发现并命名，因此又称“宫入菌”，是一种具有调节肠道微生态平衡、促进生长发育、提高免疫力、抗氧化等多种生物学功能的微生态制剂，具有较高的开发应用价值。年丁酸梭菌在日本用于饲料添加剂，而我国农业部在年将丁酸梭菌纳入微生物饲料添加剂范围。
1丁酸梭菌形态及生物学特性
丁酸梭菌是一种严格厌氧的革兰氏阳性菌，周身鞭毛，具有运动性；菌体中间略饱满呈卵圆形或圆形，表面光滑，有光泽，奶油色，在营养缺乏生长受阻时，菌体末端会形成椭圆型的芽孢[1]。丁酸梭菌作为人和动物肠道共存的肠道菌群，具有耐高热、耐胃酸、耐胆盐等多种优良特性，研究表明，丁酸梭菌经℃、5min，90℃、10min热处理后，依旧有较高的存活率，生长温度从16℃到44℃，pH值1.0仍能存活。丁酸梭菌还可产生有机酸、酶和维生素等代谢产物[2]，在饲用益生菌领域有着良好的应用前景。
2丁酸梭菌的生物学功能
2.1产生营养物质
在动物肠道内丁酸梭菌可产生多种能帮助机体消化的酶类，如纤维素酶、糖苷酶、淀粉酶和蛋白酶等，在这些消化酶的作用下多聚糖转化为低聚糖，有助于机体的消化吸收，产生的某些寡糖也为其他益生菌提供营养物质，利于益生菌的生长和繁殖。在肠道内丁酸梭菌能合成B族维生素和维生素K等物质，同时也能促进维生素E的吸收，增强动物机体的抗病能力，具有重要的保健作用。丁酸梭菌相对于其他菌种在B族维生素合成的含量上有较高水平，尤其是烟酸的合成含量是其他菌种的3～6倍。总体来说，丁酸梭菌合成的维生素种类比较丰富，对促进宿主肠道营养的全面吸收起着重要作用。
2.2抑制病原菌增殖
2.2.1分泌抗菌物质
丁酸梭菌作为益生菌在体内可以维持或恢复宿主肠道优势菌群，通过分泌短链脂肪酸、抗菌肽和丁酸梭菌素等，抑制大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、幽门螺杆菌等常见肠道致病菌的的生长。短链脂肪酸一般是食物纤维或聚糖在肠中经厌氧菌发酵后产生的，丁酸梭菌的代谢产物主要包括丁酸、乳酸、乙酸和丙酸。肠道中有机酸的分泌，可降低肠腔pH值，使有害致病菌生长受限[3]，调节微生态平衡，减少肠毒素，降低腹泻率。
丁酸梭菌素是一种能抑制和杀灭某些梭状芽孢杆菌的细菌素，具有一定的杀菌作用，对有害菌的定植起到拮抗作用。年，威尔士阿伯里斯特威斯大学Clarke从丁酸梭菌NCIB菌株首先分离得到，命名为丁酸梭菌素[4]，Konisky研究发现丁酸梭菌素是一种疏水的细菌素，经丁酸梭菌处理的细胞，其DNA、RNA和蛋白质的合成被抑制，有较强的抑菌能力。目前普遍认为细菌素杀菌作用主要通过破坏细胞膜，在膜内形成通透孔道，导致K+外流、细胞膜去极化及ATP泄露，细胞因失去溶势而死亡，丁酸梭菌可促使细胞壁上的脂磷壁酸抑制大肠杆菌在肠上皮细胞的黏附作用[5-6]。
抗菌肽(AMPs)由基因编码、核糖体合成的具有生物活性的小分子肽类，是宿主先天性免疫防御系统的重要效应分子，用于抵抗外界病原体感染。天然生物抗菌肽抗菌谱广，特别是对多重耐药菌具有杀伤作用，而且抗菌肽热稳定性和水溶性好，对高等动物的正常细胞几乎无毒害作用。且抗菌肽都具有抗病毒活性。菌肽在急性炎症反应期间能够直接趋化中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞和辅助性T细胞，并诱导中性粒细胞、单核细胞趋化因子或细胞因子的基因表达，动员先天性免疫细胞到达感染部位；刺激肥大细胞脱粒释放组织胺，随后引起血管通透性增加；增加黏附分子——整合素的表达，并促进非调节性吞噬作用。
2.2.2生物拮抗
丁酸梭菌对于肠道具有高黏附作用，可以通过黏附到肠道上皮细胞与致病菌竞争定植位点，对致病菌产生黏附竞争性抑制，减少致病菌对肠黏膜黏附和定植的机会，在一定程度上降低致病菌的增殖，促进有益菌的生长[7]。丁酸梭菌长时间定植于肠黏膜，与其他微生物竞争养分，限制致病菌的生存与繁殖，阻止菌群移位“以菌治菌”。丁酸梭菌的“占位竞争”对肠道微生物菌群的平衡、肠道细菌酶活性的稳定和肠的渗透性至关重要，研究发现，磷壁酸在丁酸梭菌的黏附能力中发挥重要作用。
2.3促进益生菌生长
丁酸梭菌产生的消化酶把多聚糖转化为有利于益生菌利用的低聚糖，给肠道有益微生物提供必需生长物质，利于益生菌的生长和繁殖，使肠道健康得到改善[7]。另外，在微生物的生态关系中存在着交叉互养现象，这是一种微生物的生存或生长依赖于另一种在其附近生活的微生物提供生长因子、营养底物的现象。研究证明在产乳酸菌和产丁酸菌之间存在交叉互养关系，乳酸菌将抗性淀粉和寡聚果糖等发酵后产生乳酸，而产丁酸菌以乳酸为底物，将乳酸转化为丁酸，而产丁酸菌产生的大量丁酸降低了结肠内的pH，为乳酸菌提供了更适宜的生存环境，例如丁酸梭菌能与双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌这些肠道有益菌共生，3种菌在与丁酸梭菌共培养条件下，活菌数分别增长了约24%、43%和7%[8]，并且还发现，对于肠道病原菌及腐败菌表现出很强的抑制作用[9-10]。
2.4增强免疫力
丁酸梭菌具有免疫调节能力，充当刺激因子，不仅能促进机体免疫器官发育，激活淋巴组织，刺激肠道黏膜的免疫活性因子诱导产生分泌型免疫球蛋白A（SIgA）、免疫球蛋白M（IgM），并对血液中白血球细胞和参与免疫调节的细胞因子产生一定影响，提高机体免疫功能。在调控炎症反应过程中，丁酸梭菌通过调控特异性受体基因表达，来调节机体的免疫通路。肠道上皮细胞中TOLL-样受体可识别细菌及其产物并被激活，丁酸梭菌能将TLR2激活，并调节髓样分化因子88(MyD88)的非依赖性途径，激活NF-κB信号通路，调控下游基因表达，TNF-α、IL-8等炎性因子的分泌，抵抗病原微生物的侵害从而抑制机体炎症反应[11]。而MyD88依赖途径，激活NF-κB主要介导炎性细胞因子的产生，导致促炎因子的过度分泌，破坏机体自身免疫功能。
肠道致病菌大量增加时，常会诱发肠道上皮细胞的异常凋亡，使致病菌易于进入深肠组织，发生细菌移位。肠道病原性大肠杆菌（EHEC）是一类主要的肠道传染性病原菌，其可以通过诱导细胞凋亡和坏死途径引发肠道疾病[12]。丁酸梭菌可以抑制EHEC诱导的凋亡因子的基因表达，同时还可以抑制蛋白活力[13]，阻断凋亡信号通路影响凋亡过程，有效地保护肠道上皮的完整性，增强机体对病原生物的抵抗，从而提高机体免疫力。
2.5保护肠黏膜屏障
丁酸是肠道上皮细胞利用效率最高的短链脂肪酸，结肠上皮细胞利用短链脂肪酸的优先顺序是丁酸、丙酸和乙酸，丁酸占结肠能量供求的70%。此外，丁酸可促进结肠蛋白质合成，促进细胞增殖，再生和修复肠道上皮组织细胞，逆转肠黏膜通透性的增加[14]。丁酸是肠道上皮组织细胞再生主要营养物质，可增加肠上皮细胞的数目，使绒毛高度增加，隐窝变浅，说明改善肠道形态结构，增强了营养吸收能力[15]。
丁酸通过抑制组蛋白去乙酰化酶的活性而实现基因调控:丁酸能够增加结肠癌细胞中的半乳糖凝集素-1的表达，这种结合半乳糖苷的凝集素与癌细胞的分化相关，并且参与了细胞黏附，预防肠癌的发生；丁酸还可上调黏液层中黏蛋白基因的表达，分泌黏液，有效抵御有害微生物入侵。丁酸还可逆转脂多糖诱导的紧密连接蛋白和闭合蛋白表达的降低，增强细胞间的紧密连接，降低细胞通透性，增强肠道屏障功能。
2.6抗应激
正常情况下，动物体自由基与机体抗氧化防御系统间处于良好的动态平衡，动物受到外外界应激时，不仅血液中血糖浓度、肌酸激酶和乳酸脱氢酶含量升高[16-17]，还会产生过量自由基，从而对机体造成损伤。研究表明，丁酸梭菌代谢产生的H2和丁酸能增强机体抗氧化酶活性，如过氧化物酶、超氧化物歧化酶、还原型辅酶I和还原型辅酶II，选择性地清除在应激状态下机体产生的自由基和活性氧[18]，丁酸还能够显著减少过氧化氢诱发的结肠细胞DNA损伤，增加结肠黏膜谷胱甘肽含量，发挥抗氧化作用，降低氧化应激[19]。此外，丁酸梭菌还可通过诱导机体和转录因子Nrf2的表达来调节抗氧化酶的表达，从而抑制肝脏的氧化应激[20]。邢帅等以断奶仔猪为研究对象，设计4组试验，对照组和试验1组饲喂基础日粮，日粮中添加丁酸梭菌0.05%（活菌数1.0×cfu·kg-1），饲喂2周后用大肠杆菌进行攻毒，血清指标显示，与对照组相比，攻毒大肠杆菌后，试验3组和试验2组相比，乳酸脱氢酶和血糖含量分别升高了41.20%（P0.01）和44.60%，说明丁酸梭菌增强了机体的抗应激能力[21]。
3丁酸梭菌在水产养殖上的应用
随着饲料端禁抗的开始，绿色、环保、无残留的益生菌饲料添加剂逐渐走进了人们的视野，丁酸梭菌因其独特的菌株优势，成为了益生菌饲料添加剂中的佼佼者，在南美白对虾以及日本沼虾[22-24]的研究中，将丁酸梭菌喷洒在饲料表面进行饲喂，可以提高虾肠道的消化酶活力，抗应激能力以及调节其肠道菌群的组成。Pan[25]使用肠细胞模型评估丁酸梭菌对嗜水气单胞菌和鳗弧菌两种鱼类病原体粘附能力的拮抗作用，结果显示丁酸梭菌可以抑制这两种病原菌在鱼类肠道的定植。Sumon等[26]研究发现，罗氏沼虾在饲喂含有丁酸梭菌饲料60d后，其消化道蛋白酶和淀粉酶活性升高，其体重和生长速率显著提高，机体免疫力增强，同时在体外试验中证明，可抑制养殖过程中致病菌哈维氏弧菌的生长；段亚飞等[]研究了日粮中添加丁酸梭菌对凡纳滨对虾的影响，发现丁酸梭菌提高了凡纳滨对虾的生长性能和饲料利用率，对其肠道结构、消化酶和SCFA含量均有促进作用，还提高了氨胁迫条件下的肠道免疫机能。
何瑞鹏等[28]在珍珠龙胆石斑鱼饲料中添加酪酸菌CBYG01，结果显示，饲料添加1×CFU/kg酪酸菌可显著提高石斑鱼的生长性能和抗氧化能力显著高于对照（P0.05）。舒琥等[29]发现在宝石饲料里添加0.5%酪酸菌能显著提高宝石鲈末体重（P0.05），显著提高肠道消化酶活性和血清抗氧化能力（P0.05）。宋增福[30]在饲料中添加丁酸梭菌喂食鮸鱼，可以提高鮸鱼的日增重，降低饵料系数；增加血浆中IgM浓度，提高肠道消化酶及血清溶菌酶活性；促进有益菌生长，抑制大肠杆菌、肠产气杆菌等致病菌的生长。另外在鮸鱼肠道上皮细胞黏附试验中，发现丁酸梭菌能够显著抑制鳗弧菌的黏附，使其黏附率降低7.03%（P0.05）。在离体实验中[31]，丁酸梭菌对鱼类肠炎沙门氏菌和副溶血性弧菌诱导的细胞凋亡有着明显的抑制作用（P0.05），表明丁酸梭菌对鱼类肠炎沙门氏菌和副溶血性弧菌引发的感染具有预防和治疗作用。
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