白癜风的发病因素有哪些 https://m-mip.39.net/nk/mipso_4611179.html摘要：Phosphoramidon是一种有效的金属蛋白酶抑制剂，是细胞生物学研究中广泛使用的工具。它包含一个二肽骨架，该骨架通过氨基磷酸酯桥与6-脱氧糖独特相连。在此，我们报告了形成磷酰胺的基因簇的鉴定及其详细表征。生物合成的体外重建将TalE确定为形成氨基磷酸酯的激酶，将TalC确定为通过磷酸酯键安装L-鼠李糖部分的糖基转移酶。
杂志名：ChemicalScience
题目：BiosyntheticreconstitutionofdeoxysugarphosphoramidatemetalloproteaseinhibitorsusinganN-P-bond-formingkinase
作者：AlexandraBaulig,IrinaHelmle,MariusBader,FelixWolf,AndreasKulik,ArwaAl-Dilaimi,DanielWibberg,JornKalinowski,HaraldGrossandLeonardKaysser
单位：DepartmentofPharmaceuticalBiology,PharmaceuticalInstitute,Universityof
Tubingen（图宾根大学）,Tubingen,Germany（德国）.
E-mail:leonard.kaysser
uni-tuebingen.
图1：含有氨基磷酸酯或氨基磷酸部分的精选天然产物。
Phosphoramidon（1）及其立体异构体talopeptin(2)已从Streptomyces培养液中分离出来，是金属内肽酶的有效抑制剂，包括嗜热菌蛋白酶、假单胞菌弹性蛋白酶LasB、中性内肽酶和内皮素转化酶。1和2的抑制活性归因于氨基磷酸酯部分的金属螯合特性，该部分独特地将脱氧糖连接到L-Leu-L-Trp二肽骨架的N端。脱氧糖在1的情况下由L-鼠李糖组成，在2的情况下由6-脱氧-L-塔罗糖组成。这两个分子属于一小组结构不同的具有N-P键的天然产物。已经鉴定了大肠杆菌中的microcinC7(3)、放射性土壤杆菌中的agrocin84、链霉菌属WM中的fosfazinomycin和丁香假单胞菌中的phaseolotoxin的生物合成基因簇(BGC)。鉴于与3的结构差异和没有腺苷酸，我们推测了一种独特的生物合成策略，以在1和2中形成氨基磷酸酯桥。图2：1和2的生物合成。
(A)来自S.mozunensisMK-23的taloseBGC的组织和基因簇表。在本研究过程中删除的基因标为(Δ)。紫色箭头：生物合成基因。绿色箭头：运输和监管。(B)1的生物合成的建议途径。
Cpz31是一种来自caprazamycin基因簇的鼠李糖基转移酶，作为参考来扫描基因组序列，假设同源酶可能参与2中脱氧糖的安装。通过BLAST比较揭示了一个同源物TalC，与Cpz31具有45%的序列同一性。各个基因与推定的ATP-graspenzyme(TalD)和推定的PEP合酶/丙酮酸、磷酸二激酶(TalE)的基因位于同一位置。与这种类似操纵子的小结构相邻的是编码运输和调节功能的假定基因。基于这些发现，可以想象到2（和1）的三步反应途径。TalD将从L-Leu和L-Trp形成二肽(4)。这可以作为TalE安装N端氨基磷酸酯生成5的前体。脱氧糖的后续转移可以由TalC催化得到2。图3：Streptomycessp.MK-62F2/talMB01中产生1和在S.mozunensisMK-23中产生2的培养物提取物的LC-MS分析。提取离子色谱图(EIC)。为了确认推定的tal基因簇，我们将整合pCC1FOS衍生物的途径转移Streptomycessp.MK-62F2中进行异源表达。对异源突变体培养提取物的LC-MS分析显示，产生的单个新峰质量、保留时间和紫外光谱与标准1相同，但保留时间变化2.2min。为了明确地确定tal簇的组织和边界，分别了基因talC、talD和talE以及边界区域orf-7-orf-1和orf+1-orf+12，并异源表达突变簇。突变菌株培养物提取物的LC-MS分析表明，1的生物合成不受Δorf-7-orf-1和Δorf+1-orf+12缺失的影响。相比之下，ΔtalC、ΔtalD和ΔtalE突变导致明显的生产损失。为了明确指定TalD在1和2的生物合成中的作用，用合成的4补充了ΔtalD突变体的培养物。培养物提取物的LC-MS分析表明，二肽的加入在很大程度上恢复了突变体中1的产生。
图4：酶反应的LC-MS分析。
m/z[M-H]-(1)、m/z[M-H]-(5)和m/z[M-H]-(4)的提取离子色谱图(EIC)。(a)1的商业标准。(b)使用TalC（ΔtalE突变体的蛋白质提取物）、dTDP-L-鼠李糖、TalE、4和ATP的酶促测定显示4到1的转化。(c)使用ΔtalC突变体的蛋白质提取物在没有TalC的情况下对(b)进行的对照测定。(d)(b)不含dTDP-L-鼠李糖的对照测定。(e)对照测定：ΔtalC突变体的蛋白质提取物与4。(f)对照测定：ΔtalE突变体的蛋白质提取物与4。(g)TalE与4和ATP的酶促测定显示4到5的转化。(h)(g)不含TalE的对照测定。(i)(g)不含ATP的对照测定。(j)不含4的(g)对照分析。方框：观察到的NMR相关性为5。
将纯化的His-TalE与ATP和合成的4一起孵育，然后在30°C下反应2小时。反应混合物的LC-MS分析显示在保留时间8.4分钟处存在额外的质量峰5，m/z为.1[M-H]-。这种新化合物的产生取决于TalE的浓度，并且当省略其中一种测定成分时会不存在。在TalE中添加了dTDP-L-鼠李糖和含有TalC的蛋白质提取物。在30°C下孵育16小时后，通过LC-MS分析了反应混合物，并在保留时间、UV光谱、质量和MS/MS碎裂方面鉴定了与1匹配的单一产物峰。
结论：综上所述，我们已经鉴定了磷酰胺金属蛋白酶抑制剂生物合成的基因簇。化学互补和体外重组揭示了形成1和2的三个反应途径，这涉及特殊的生物化学。ATP-酰胺连接酶、磷酰转移酶和脱氧糖转移酶共同作用于两种氨基酸的缩合，随后6-脱氧核糖通过磷酸化桥连接到所得到的二肽。在公共基因组数据库中的初步搜索发现了一些同源途径，其中包含一个类似talCDE的假定操纵子。鉴于编码的ATP-grass酶和糖基转移酶可能分别表达不同于TalD和TalC的底物耐受性，所鉴定的基因簇可能指导新的金属蛋白酶抑制剂的合成。此外，这两种酶都有潜力作为生物活性小分子的体内和体外工程的生物催化剂。预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇
